טכנולוגיית פפטיד FRET

העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET)

העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET) היא תהליך העברת אנרגיה לא-קרינה, שבו אנרגיית המצב הנרגש של התורם מועברת למצב הנרגש של הקבלן באמצעות אינטראקציה של זוגות חשמליים בין מולקולריים.תהליך זה אינו מערב פוטונים ולכן אינו קרינה.לבדיקה זו יש את היתרונות של היותו מהיר, רגיש ופשוט.

הצבע המשמש במבחן FRET יכול להיות זהה.אבל ברוב היישומים, למעשה משתמשים בצבעים שונים.בקצרה, העברת אנרגיית תהודה זוהרת היא העברה של זוג דיפולים מהתורם (צבע 1) למקבל (צבע 2) כאשר קבוצת התורמים נרגשת.באופן כללי, ספקטרום הפליטה של ​​קבוצת הפלואורופור התורם חופף לספקטרום הספיגה של קבוצת Acceptor."כאשר המרחק בין שני הפלואורופורים מתאים (10 - 100 A), ניתן לראות את העברת אנרגיית הפלואורופורים מהתורם למקבל."שיטת העברת האנרגיה תלויה במבנה הכימי של הקולטן:

1. מומר לרטט מולקולרי, כלומר, האור הזוהר של העברת האנרגיה נעלם.(הקולטן הוא מרווה אור)

2. הפליטה אינטנסיבית יותר מהקולטן עצמו, וכתוצאה מכך להסטה לאדום בספקטרום הקרינה המשני".(קולטנים הם פולטי אור).

קבוצת התורמים (EDANS) והגן המקובל (DABCYL) מקושרים באופן אחיד למצע הטבעי של פרוטאז HIV, וכאשר המצע אינו מנותק, DABCYL יכול לדכא את EDANS ולאחר מכן להפוך לבלתי ניתן לזיהוי לפלואור.עם ניתוק פרוטאז HIV-1, EDANS כבר לא מרוווה על ידי DABCYL, וניתן לזהות EDANS luciferases לאחר מכן.ניתן לעקוב אחר הזמינות של מעכבי פרוטאז על ידי שינויים בעוצמת הקרינה של EDANS.

פפטידי FRET הם כלים נוחים לחקר אי-ספציפיות של פפטידאז.מכיוון שניתן לעקוב אחר תהליך התגובה שלו באופן רציף, הוא מספק שיטה נוחה לזיהוי פעילות האנזים.הברק שנוצר לאחר הידרוליזה של קשרי פפטיד על ידי התורם/המקבל מספק מדד לפעילות האנזים בריכוזים ננומולריים.כאשר פפטיד FRET שלם, הוא מראה היעלמות פתאומית של ההבזק הפנימי, אך כאשר כל קשר פפטיד מול התורם/המקבל נשבר, הוא משחרר הבזק, אותו ניתן לזהות באופן רציף ולאחר מכן ניתן לכמת את פעילות האנזים.