פפטידים הם מחלקה של תרכובות הנוצרות על ידי חיבור של חומצות אמינו מרובות באמצעות קשרי פפטידים.הם נמצאים בכל מקום באורגניזמים חיים.עד כה, עשרות אלפי פפטידים נמצאו באורגניזמים חיים.לפפטידים תפקיד חשוב בוויסות הפעילות התפקודית של מערכות, איברים, רקמות ותאים שונים ובפעילויות חיים, והם משמשים לעתים קרובות בניתוח פונקציונלי, חקר נוגדנים, פיתוח תרופות ותחומים נוספים.עם התפתחות הביוטכנולוגיה וטכנולוגיית סינתזת הפפטידים, יותר ויותר תרופות פפטידים פותחו ויושמו בקליניקה.
קיים מגוון רחב של שינויים בפפטידים, שניתן לחלקם בפשטות לשינוי לאחר שינוי ושינוי תהליך (באמצעות שינוי חומצות אמינו נגזרות), ושינוי N-טרמינלי, שינוי C-טרמינלי, שינוי שרשרת צד, שינוי חומצות אמינו, שינוי שלד, וכו', בהתאם לאתר השינוי (איור 1).כאמצעי חשוב לשינוי מבנה השרשרת הראשי או קבוצות השרשרת הצדדיות של שרשראות פפטידים, שינוי פפטידים יכול לשנות ביעילות את התכונות הפיזיקליות והכימיות של תרכובות פפטידים, להגביר את מסיסות המים, להאריך את זמן הפעולה in vivo, לשנות את התפוצה הביולוגית שלהם, לחסל את האימונוגניות. , הפחתת תופעות לוואי רעילות וכו'. במאמר זה מוצגות מספר אסטרטגיות עיקריות לשינוי פפטידים והמאפיינים שלהן.
1. מחזוריות
לפפטידים מחזוריים יש יישומים רבים בביו-רפואה, ופפטידים טבעיים רבים בעלי פעילות ביולוגית הם פפטידים מחזוריים.מכיוון שפפטידים מחזוריים נוטים להיות נוקשים יותר מפפטידים ליניאריים, הם עמידים ביותר למערכת העיכול, יכולים לשרוד במערכת העיכול ולהפגין זיקה חזקה יותר לקולטני המטרה.מחזוריות היא הדרך הישירה ביותר לסנתז פפטידים מחזוריים, במיוחד עבור פפטידים עם שלד מבני גדול.על פי מצב המחזור, ניתן לחלק אותו לסוג שרשרת צד-שרשרת, טרמינל - סוג שרשרת צד, טרמינל - סוג מסוף (סוג מקצה לקצה).
(1) שרשרת צד לשרשרת צד
הסוג הנפוץ ביותר של מחזור של שרשרת צד לשרשרת צד הוא גישור דיסולפיד בין שיירי ציסטאין.מחזוריות זו מוכנסת על ידי זוג שאריות ציסטאין שמוסרים את ההגנה ולאחר מכן מתחמצנים ליצירת קשרי דיסולפיד.ניתן להשיג סינתזה פוליציקלית על ידי הסרה סלקטיבית של קבוצות הגנה מסוג sulfhydryl.מחזוריות יכולה להיעשות בממס לאחר ניתוק או על שרף טרום ניתוק.מחזור על שרפים עשוי להיות פחות יעיל ממחזור ממס מכיוון שהפפטידים על שרפים אינם יוצרים בקלות קונפורמציות מחזוריות.סוג אחר של שרשרת צד - ציקליזציה של שרשרת צד הוא יצירת מבנה אמידי בין שארית חומצה אספרטית או חומצה גלוטמית לבין חומצת האמינו הבסיסית, מה שמחייב את קבוצת ההגנה על שרשרת הצד חייבת להיות מסוגלת להסיר באופן סלקטיבי מהפוליפפטיד. על השרף או לאחר דיסוציאציה.הסוג השלישי של שרשרת צד - ציקליזציה של שרשרת צד היא יצירת אתרים דיפניל על ידי טירוזין או p-hydroxyphenylglycine.סוג זה של מחזור במוצרים טבעיים נמצא רק במוצרים מיקרוביאליים, ולמוצרי מחזור יש לרוב ערך רפואי פוטנציאלי.הכנת תרכובות אלו דורשת תנאי תגובה ייחודיים, ולכן אין בהם שימוש לעתים קרובות בסינתזה של פפטידים קונבנציונליים.
(2) מסוף-לצד-שרשרת
מחזור שרשרת צדדי טרמינלי כרוך בדרך כלל ב-C-טרמינל עם קבוצת האמינו של השרשרת הצדדית של ליזין או אורניתין, או ב-N-טרמינל עם שרשרת הצד של חומצה אספרטית או חומצה גלוטמית.מחזור פוליפפטיד אחר נעשה על ידי יצירת קשרי אתר בין טרמינל C לשרשראות צד של סרין או תראונין.
(3) סוג טרמינל או ראש אל זנב
פוליפפטידים של שרשרת יכולים להיות מחזוריים בממס או קבועים על שרף על ידי מחזוריות שרשרת צדדית.יש להשתמש בריכוזים נמוכים של פפטידים בריכוז ממס כדי למנוע אוליגומריזציה של פפטידים.התשואה של פוליפפטיד טבעת סינתטית ראש אל זנב תלויה ברצף של פוליפפטיד השרשרת.לכן, לפני הכנת פפטידים מחזוריים בקנה מידה גדול, יש ליצור תחילה ספרייה של פפטידים עופרת משורשרים אפשריים, ולאחר מכן לבצע מחזוריות כדי למצוא את הרצף עם התוצאות הטובות ביותר.
2. N-מתילציה
N-methylation מתרחשת במקור בפפטידים טבעיים ומוכנסת לסינתזת פפטידים כדי למנוע היווצרות של קשרי מימן, ובכך להפוך את הפפטידים עמידים יותר לפירוק ביולוגי ולפינוי.סינתזה של פפטידים באמצעות נגזרות N-methylated חומצות אמינו היא השיטה החשובה ביותר.בנוסף, ניתן להשתמש בתגובת Mitsunobu של N-(2-nitrobenzene sulfonyl chloride) פוליפפטיד-שרף עם מתנול.שיטה זו שימשה להכנת ספריות פפטידים מחזוריות המכילות חומצות אמינו N-methylated.
3. זרחון
זרחון הוא אחד השינויים הפוסט-תרגום הנפוצים ביותר בטבע.בתאים אנושיים, יותר מ-30% מהחלבונים עוברים פוספורילציה.זרחון, במיוחד זרחון הפיך, ממלא תפקיד חשוב בבקרת תהליכים תאיים רבים, כגון העברת אותות, ביטוי גנים, ויסות מחזור התא ושלד הציטוס, ואפופטוזיס.
ניתן להבחין בזרחן במגוון של שיירי חומצות אמינו, אך יעדי הזרחון הנפוצים ביותר הם שרידי סרין, תראונין וטירוזין.נגזרות של פוספוטירוזין, פוספוטרונין ופוספוסרין יכולות להיות מוכנסות לפפטידים במהלך הסינתזה או להיווצר לאחר סינתזת פפטידים.ניתן להשיג זרחון סלקטיבי באמצעות שאריות של סרין, תראונין וטירוזין המסירים באופן סלקטיבי קבוצות הגנה.ריאגנטים מסוימים של זרחון יכולים גם להכניס קבוצות חומצה זרחתית לפוליפפטיד על ידי שינוי לאחר.בשנים האחרונות, זרחון ספציפי לאתר של ליזין הושג באמצעות תגובה סלקטיבית מבחינה כימית של Staudinger-phosphite (איור 3).
4. מיריסטוילציה ופמטיולציה
אצילציה של מסוף ה-N עם חומצות שומן מאפשרת לפפטידים או חלבונים להיקשר לממברנות התא.הרצף ה-myridamoylated על ה-N-terminal מאפשר לכוון את חלבוני קינאזות החלבון של משפחת Src וחלבוני ה-Reverse transcriptase Gaq להיקשר לממברנות התא.חומצה מיריסטית נקשרה ל-N-טרמינל של השרף-פוליפפטיד באמצעות תגובות צימוד סטנדרטיות, וניתן היה לנתק את הליפופפטיד שנוצר בתנאים סטנדרטיים ולטהר על ידי RP-HPLC.
5. גליקוזילציה
גליקופפטידים כגון ונקומיצין וטיקולנין הם אנטיביוטיקה חשובה לטיפול בזיהומים חיידקיים עמידים לתרופות, ולעתים קרובות משתמשים בגליקופפטידים אחרים כדי להמריץ את מערכת החיסון.בנוסף, מכיוון שהרבה אנטיגנים מיקרוביאליים עוברים גליקוזילציה, יש משמעות רבה לחקור גליקופפטידים לשיפור ההשפעה הטיפולית של זיהום.מצד שני, נמצא שהחלבונים על קרום התא של תאי הגידול מציגים גליקוזילציה לא תקינה, מה שגורם לגליקופפטידים למלא תפקיד חשוב בחקר ההגנה החיסונית של סרטן וגידול.הגליקופפטידים מוכנים בשיטת Fmoc/t-Bu.שאריות סוכריות, כגון תריונין וסרין, מוכנסות לעתים קרובות לפוליפפטידים על ידי fMOCs המופעלים על ידי פנטפלואורופנול אסטר כדי להגן על חומצות אמינו מסוכררות.
6. איזופרן
איזופנטדינילציה מתרחשת על שיירי ציסטאין בשרשרת הצדדית ליד טרמינל C.איזופרן חלבון יכול לשפר את הזיקה של ממברנת התא וליצור אינטראקציה בין חלבון לחלבון.חלבונים עם איזופנטדיאן כוללים טירוזין פוספטאז, GTase קטן, מולקולות קוצ'פרון, רצועה גרעינית וחלבונים קושרים צנטרומריים.ניתן להכין פוליפפטידים של איזופרן באמצעות איזופרן על שרפים או על ידי החדרת נגזרות ציסטאין.
7. שינוי פוליאתילן גליקול (PEG).
ניתן להשתמש בשינוי PEG כדי לשפר את היציבות ההידרוליטית של החלבון, ההפצה הביולוגית ומסיסות הפפטידים.הכנסת שרשראות PEG לפפטידים יכולה לשפר את התכונות הפרמקולוגיות שלהם וגם לעכב הידרוליזה של פפטידים על ידי אנזימים פרוטאוליטיים.פפטידי PEG עוברים דרך חתך הנימים הגלומרולרי בקלות רבה יותר מאשר פפטידים רגילים, ומפחיתים מאוד את הפינוי הכלייתי.בשל זמן מחצית החיים הפעיל הממושך של פפטידי PEG in vivo, ניתן לשמור על רמת הטיפול הרגילה עם מינונים נמוכים יותר ותרופות פפטידים בתדירות נמוכה יותר.עם זאת, לשינוי PEG יש גם השפעות שליליות.כמויות גדולות של PEG מונעות מהאנזים את פירוק הפפטיד וגם מפחיתות את הקישור של הפפטיד לקולטן המטרה.אבל הזיקה הנמוכה של פפטידי PEG מקוזזת בדרך כלל על ידי זמן מחצית החיים הפרמקוקינטי הארוך יותר שלהם, ועל ידי הימצאותם בגוף זמן רב יותר, לפפטידי PEG יש סבירות גבוהה יותר להיספג ברקמות המטרה.לכן, יש לבצע אופטימיזציה של מפרטי פולימר PEG לקבלת תוצאות מיטביות.מצד שני, פפטידי PEG מצטברים בכבד עקב פינוי כליות מופחת, וכתוצאה מכך תסמונת מקרו-מולקולרית.לכן, שינויי PEG צריכים להיות מתוכננים בזהירות רבה יותר כאשר משתמשים בפפטידים לבדיקת תרופות.
ניתן לסכם באופן גס את קבוצות השינוי הנפוצות של משפרי PEG כדלקמן: אמינו (-אמין) -NH2, aminomethyl-Ch2-NH2, hydroxy-OH, carboxy-Cooh, sulfhydryl (-Tiol) -SH, Maleimide -MAL, succinimide carbonate - SC, succinimide acetate -SCM, succinimide propionate -SPA, n-hydroxysuccinimide -NHS, Acrylate-ch2ch2cooh, aldehyde -CHO (כגון propional-ald, butyrALD), בסיס אקרילי (-acrylate-acrl), azido-azide, biotinyl- ביוטין, פלואורסין, גלוטריל -GA, Acrylate Hydrazide, alkyne-alkyne, p-toluenesulfonate -OTs, succinimide succinate -SS וכו'. נגזרות PEG עם חומצות קרבוקסיליות יכולות להיות מחוברות לאמינים n-טרמינליים או לשרשראות צד של ליזין.ניתן לחבר PEG המופעל על ידי אמינו לשרשראות צד של חומצה אספרטית או חומצה גלוטמית.ניתן להצמיד PEG המופעל על ידי Mal למרקפטן של שרשראות צד של ציסטאין שהוסרו לחלוטין [11].בדרך כלל ניתן לסווג את משפרי PEG כדלקמן (הערה: mPEG הוא מתוקסי-PEG, CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH):
(1) משנה PEG שרשרת ישרה
mPEG-SC, mPEG-SCM, mPEG-SPA, mPEG-OTs, mPEG-SH, mPEG-ALD, mPEG-butyrALD, mPEG-SS
(2) משנה PEG דו-פונקציונלי
HCOO-PEG-COOH, NH2-PEG-NH2, OH-PEG-COOH, OH-PEG-NH2, HCl·NH2-PEG-COOH, MAL-PEG-NHS
(3) משנה PEG מסועף
(mPEG)2-NHS, (mPEG)2-ALD, (mPEG)2-NH2, (mPEG)2-MAL
8. ביוטיניזציה
ביוטין יכול להיקשר חזק עם אבידין או סטרפטאבידין, וחוזק הקישור אפילו קרוב לקשר קוולנטי.פפטידים המסומנים ביוטין נמצאים בשימוש נפוץ בבדיקות אימונו, היסטוציטוכימיה וציטומטריית זרימה מבוססת פלואורסצנציה.נוגדני אנטיביוטין מסומנים יכולים לשמש גם לקשירת פפטידים ביוטיניליים.תוויות ביוטין מחוברות לרוב לשרשרת הצדדית של ליזין או למסוף N.חומצה 6-אמינוקפרואית משמשת לעתים קרובות כקשר בין פפטידים לביוטין.הקשר גמיש בקשירה למצע ונקשר טוב יותר בנוכחות הפרעה סטרית.
9. תיוג פלורסנטי
ניתן להשתמש בתיוג פלורסנטי כדי להתחקות אחר פוליפפטידים בתאים חיים ולחקור אנזימים ומנגנוני פעולה.טריפטופן (Trp) הוא ניאון, כך שניתן להשתמש בו לתיוג מהותי.ספקטרום הפליטה של טריפטופן תלוי בסביבה ההיקפית ויורד עם ירידה בקוטביות הממס, תכונה שימושית לזיהוי מבנה פפטיד וקשירה לקולטן.ניתן לכבות את הקרינה של טריפטופן על ידי חומצה אספרטית פרוטונית וחומצה גלוטמית, מה שעלול להגביל את השימוש בה.קבוצת הדנסיל כלוריד (Dansyl) היא ניאון גבוהה כאשר היא קשורה לקבוצת אמינו ומשמשת לעתים קרובות כתווית ניאון לחומצות אמינו או חלבונים.
המרת אנרגיה תהודה פלואורסצנטית (FRET) שימושית למחקרי אנזימים.כאשר FRET מוחל, הפוליפפטיד המצע מכיל בדרך כלל קבוצת תיוג פלואורסצנטי וקבוצה מרווה פלואורסצנציה.קבוצות פלואורסצנטיות מסומנות נכבות על ידי המרווה באמצעות העברת אנרגיה שאינה פוטון.כאשר הפפטיד מתנתק מהאנזים המדובר, קבוצת התיוג פולטת פלואורסצנטיות.
10. פוליפפטידים של כלוב
לפפטידים של כלוב יש קבוצות הגנה הניתנות להסרה אופטית המגנות על הפפטיד מקישור לקולטן.בעת חשיפה לקרינת UV, הפפטיד מופעל, ומשחזר את הזיקה שלו לקולטן.מכיוון שניתן לשלוט בהפעלה אופטית זו על פי זמן, משרעת או מיקום, ניתן להשתמש בפפטידים בכלוב כדי לחקור תגובות המתרחשות בתאים.קבוצות ההגנה הנפוצות ביותר עבור פוליפפטידים בכלוב הן קבוצות 2-ניטרובנזיל ונגזרותיהן, אותן ניתן להכניס לסינתזת פפטידים באמצעות נגזרות של חומצות אמינו מגן.נגזרות חומצות אמינו שפותחו הן ליזין, ציסטאין, סרין וטירוזין.עם זאת, לא נעשה שימוש נפוץ בנגזרות של אספרטאט וגלוטמט בשל רגישותם למחזוריות במהלך סינתזה ופירוק פפטידים.
11. פפטיד פוליאנטיגני (MAP)
פפטידים קצרים בדרך כלל אינם חסינים וחייבים להיות מחוברים לחלבוני נשאים כדי לייצר נוגדנים.פפטיד פוליאנטיגני (MAP) מורכב ממספר פפטידים זהים המחוברים לגרעיני ליזין, שיכולים לבטא באופן ספציפי אימונוגנים בעלי עוצמה גבוהה וניתן להשתמש בהם להכנת צמדי חלבון נושאי פפטיד.ניתן לסנתז פוליפפטידים של MAP על ידי סינתזה של פאזה מוצקה על שרף MAP.עם זאת, צימוד לא שלם גורם לשרשראות פפטידים חסרות או קטומות בענפים מסוימים ולכן אינו מציג את התכונות של הפוליפפטיד המקורי של MAP.כחלופה, ניתן להכין ולטהר פפטידים בנפרד ולאחר מכן לחבר ל-MAP.רצף הפפטידים המחובר לליבת הפפטידים מוגדר היטב ומאופיין בקלות על ידי ספקטרומטריית מסה.
סיכום
שינוי פפטידים הוא אמצעי חשוב לעיצוב פפטידים.פפטידים שעברו שינוי כימי יכולים לא רק לשמור על פעילות ביולוגית גבוהה, אלא גם למנוע ביעילות את החסרונות של אימונוגניות ורעילות.יחד עם זאת, שינוי כימי יכול להעניק לפפטידים כמה תכונות מצוינות חדשות.בשנים האחרונות פותחה במהירות שיטת ההפעלה של CH לפוסט-מודיפיקציה של פוליפפטידים, והושגו תוצאות חשובות רבות.
זמן פרסום: 20-20-2023